Au cinéma, il incarna d'abord des personnages comiques de second plan, alternant films alimentaires oubliés ou productions plus ambitieuses où ses rôles marquèrent le public, notamment dans La Guerre des boutons d'Yves Robert ou Zazie dans le métro de Louis Malle.
Familier de l'univers de Jean-Pierre Mocky, pour lequel il a joué plusieurs fois, la carrière de Jacques Dufilho évolua dans les années 1970 à la faveur d'un premier rôle dans Une journée bien remplie de Jean-Louis Trintignant, où il incarnait un boulanger assassin dans un rôle presque muet, et d'un emploi de chef-mécanicien récompensé par un César du meilleur acteur dans un second rôle dans Le Crabe-tambour. Épicier patriote dans La Victoire en chantant de Jean-Jacques Annaud la même année 1976, film récompensé par un Oscar du meilleur film en langue étrangère, puis paysan bigouden dans l'adaptation par Claude Chabrol du Cheval d'orgueil, il fut à nouveau césarisé pour son rôle de vieil homosexuel dans Un mauvais fils de Claude Sautet en 1980.